CTC College

CTC学院

在传统临床实践中,获得肿瘤患者组织样本只有手术活检和穿刺活检两种。转移期肿瘤患者体内可能有多个肿瘤病灶，具体到从哪个病灶获取肿瘤组织样本是一大问题。

肿瘤患者血液中存在少量循环肿瘤细胞以及由坏死癌细胞释放的少量循环肿瘤 DNA。通过检测血液中的循环肿瘤细胞（CTC，circulating tumor cell）和循环肿瘤DNA（ctDNA，circulating tumor DNA）对患者肿瘤进行诊断与监测的方法被称为液体活检。相比于传统的活检方法，液体活检具有副作用小、操作简单、能重复取样等优点。

Credit: H. McDonald/Science Translational Medicine

最新研究证实，除了从已形成的实体瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落进入血液外，肿瘤细胞在形成实体瘤病灶之前便有可能进入血液系统中，由此提示循环肿瘤细胞的存在往往要早于影像学或临床症状的表现。

近几年CTC检测在肿瘤辅助诊断、监控等方面的临床表现逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时监测手段之一。大量实验已经证实CTC检测有助于肿瘤的早期诊断、预后评估、疗效监测及个体化治疗方案制定等。

redit:Catherine Alix-Panabieres et al.
Clinical Chemistry. 2013;59(1):110-118.

CTC--肿瘤标志物

   2007年ASCO将CTC纳入肿瘤标志物。

CTC被多个指南认可

2010年 美国AJCC《肿瘤分期指南》（第七版）

首次把CTC列入TNM分期系统，作为一个新的M分期（远端转移）标准，列为cM0(i+)分期，出现在M0和M1之间。

2017年 美国NCCN乳腺癌临床实践指南

正式引入cM0(i+)分期。

2018年 美国AJCC《肿瘤分期指南》（第八版）

明确CTC为乳腺癌预后评估工具之一：临床晚期乳腺癌外周血CTC≥5个/7.5ml及临床早期乳腺癌外周血CTC≥1个/7.5ml提示预后不良。

2018年 中华医学会检验医学分会/国家卫生健康委员会临检中心

《液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识》

CTC检测可用于转移性结直肠癌、乳腺癌与前列腺癌的进展/不良预后早期预警。

2019年 中国CSCO《乳腺癌诊疗指南》

CTC能够反映肿瘤组织的情况，也可以用无创方式替代组织样本进行病理诊断、疾病监测、分子测序等，不仅可以动态监测，还可以用于判断预后。

CTC检测可用于转移性结直肠癌、乳腺癌与前列腺癌的进展/不良预后早期预警。

左图：结直肠癌中间质表型的CTC预示着疾病更恶性与转移潜能更强。

Zhao R, et al. Oncotarget. 2017 Feb 7;8(6):9293‐9302.

右图：上皮间质转化（EMT）表型CTC是乳腺癌远端转移的潜在生物标志物。

Zhang S, Wu T, et al. Cancer Manag Res. 2017 Nov 23;9:691‐700.

目前CTC的应用主要在以下几个方面：
1. 在常规手段无法对早期肿瘤进行判断时进行辅助诊断。
2. 在伴随诊断、疗效评估方面，癌症患者进行化疗、靶向治疗后进行CTC 检测，若CTC 数量减少，提示治疗方式可能有效。相比于现阶段的检查手段，CTC 检测技术操作更方便，应用更简单，可以更及时地提示医生该患者是否适合化疗或靶向治疗。
3. 在术后监测方面，主要是由于活检无法高频次检测，而目前CTC 检测在术后监测中应用可能更方便，检测频次会更高。

循环肿瘤细胞（CTC）的特性
1. 稀有性：每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞。
2. 非典型性的细胞形态：一般比血液细胞，正常组织细胞体积大；细胞核大，不规则，细胞核质比高；不易发生变形。
3. 异质性：细胞表面抗原标志物表达差异，携带不同的分子信息，转移潜力差异。
4. 不同类别：CTC可以是间质型、上皮型或者上皮间质混合型，CTC也既可以是单个细胞的CTC也可以是成团的CTCs(CTM)。

CTC富集和检测方法

人体循环系统中CTC的含量极低,肿瘤转移患者每毫升全血中仅有1～10 个CTC，因此要实现CTC的检测对其进行分选富集是一个必不可少的步骤。CTC分选富集效果的优劣将会直接影响其后续的检测(计数、基因扩增、基因测序等)效果,因此高纯度、高灵敏性(不丢失CTC)、快速、高细胞活性的CTC分选富集是CTC临床应用的重点和难点。

CTC 的富集方法可以分为免疫亲和富集法和物理特性富集法。免疫亲和法主要是根据细胞表面表达的特异性的蛋白将CTC筛选出来，物理特性富集主要是根据CTC 的大小和密度等特性将这些细胞筛选出来。微流控芯片技术凭借多种优势已经在CTC富集分选中得到越来越广泛的应用，有望在将来成为CTC富集和检测工具之一。

利用免疫亲和或物理特性法可富集到CTC，接下来还需要结合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC捕获技术不能保证百分之百的纯度，需要对所得到的细胞进行鉴定，以进一步确定CTC细胞的数目，以减少CTC数目判定的假阳性率和假阴性率。另一方面，在肿瘤的发生发展过程中，不仅CTC的数目在动态的变化，CTC所携带的分子标志物也在变化，通过对CTC表面标志物检测，能够反应肿瘤发生发展的动态变化，是研究肿瘤发生发展机制的有效策略，并能很好地指导临床治疗。

常用的CTC检测技术如免疫荧光、PCR、FISH及高通量测序等。
1. 免疫荧光法（IF）: 实体肿瘤细胞一般均为上皮来源，细胞内会表达角蛋(cytokeratin, CK)或其他肿瘤标示物(如HER2)。借助免疫荧光染色，可对来自实体瘤CTC中的瘤标进行识别，从而达到检测CTC的目的。这也是目前检测CTC的最常见方法。缺点是，在CTC形成过程的间质化(EMT)阶段，大量的CK会降解，从而在CTC检测过程中出现假阴性。
2. 荧光原位杂交（FISH）: 荧光原位杂交，是根据已知细胞内特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与细胞内的基因组中DNA分子杂交，检测该特异基因序列的存在与丰度。FISH技术与CTC结合，不仅可以检测CTC表面标志物，也可以检测CTC细胞内部的标志物及核型等。
3. RT-PCR，反转录PCR: 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用引物和逆转录酶将mRNA反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。结合RT-PCR可同时对若干个基因的表达进行检测。位点特异性PCR技术可用于检测CTC携带的驱动基因的突变情况。
4. 二代测序 : CTC数量少，直接进行二代测序难度大。需要将单细胞的DNA扩增后，再利用二代测序检查基因序列。但是，目前单细胞测序的技术仅仅停留在实验室阶段，未来向市场推广还有很长的路要走。而且由于肿瘤细胞的异质性，单细胞测序是否有代表性还需要更多的科学研究来证明。

CTC技术概述